複雑な培地から細胞外小胞を表面マーカー特異的に分離するための並列免疫磁気ナノポアソーティングのモデリングと最適化

Scientific Reports volume 13、記事番号: 13292 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

表面マーカーの発現に基づいて細胞外小胞（EV）の特定の部分集団を単離することは、そのナノスケールサイズ（< 800 nm）、不均一な表面マーカー発現、および臨床検体中に存在する膨大な数のバックグラウンド EV により、重大な課題を引き起こします。 (血中 1010 ～ 1012 EV/mL)。トラックエッチング磁気ナノポア (TENPO) チップを使用した高度に並列化されたナノ磁気選別は、高スループットと目詰まりに対する回復力を備えた正確な免疫特異的選別を実現しました。ただし、このアプローチでは、スループット、ターゲット EV 回収、およびバックグラウンド EV を破棄する能力のトレードオフを制御する設計パラメータの体系的な研究はまだ行われていません。私たちは有限要素シミュレーションと TENPO チップの実験的特性評価を組み合わせて、血液から EV 部分集団を分離するための設計ルールを解明します。我々は、細孔径、直列に配置された膜の数、および流量を選択することにより、ターゲットEVの回収を犠牲にすることなく、以前に公開された設計と比較してデバイスのバックグラウンドを10倍以上削減することにより、このアプローチの有用性を実証します。我々は、TENPO で分離された EV を EV 分離のゴールドスタンダード手法と比較し、肺がん、膵臓がん、肝臓がんなどの複数の疾患モデルからの EV の部分集団をターゲットにすることで、幅広い応用とモジュール性に対するその有用性を実証します。

細胞外小胞（EV）は、核酸カーゴを含み、元の細胞を反映する表面タンパク質を発現するナノスケール（< 800 nm）の膜状粒子です1。 EV は、複数の積荷を持ち、血液脳関門などの解剖学的関門を回避して血液 (1010 ～ 1012 EV/mL)2 や尿 (1010 EV/mL)3 などの末梢体液中を循環する能力があるため、複数のがん 4、5、6、7、8、9 だけでなく、外傷性脳損傷 10 や感染症 11 などの他の疾患の状況においても、診断と特性評価のための有望なバイオマーカーソースです。さらに、EV は、がんにおける転移播種 12 や腫瘍と免疫相互作用 13 などの生物学的プロセスや、外傷性脳損傷 14、自己免疫疾患 15、心停止 16 などの病態においても機構的な役割を果たしています。

現在、EV の研究とその診断や治療の可能性は、生体標本中のナノスケールのサイズ、複雑さ、量の独特な組み合わせに対処するように設計されていない技術によって妨げられています。血中の高濃度のEVは、特定のEV亜集団を他のEV亜集団や、同じサイズ範囲の細胞破片などの他の非EV粒子（無関係な「バックグラウンド」）から区別しようとする研究者にとって、特別な課題となっています。。超遠心分離、市販の沈殿キット (Thermo Fisher、System Biosciences)、サイズ排除クロマトグラフィーなどの現在のゴールドスタンダード EV 単離方法には、EV 部分集団を正確に選別するための表面マーカー選択性とスループットが不足しています 17。

同様に、これまでに確立された細胞の表面マーカー選別方法では、ナノスケールのEVを測定したり、臨床サンプルで通常見られる多数のEVを処理するスループットを達成したりすることができません。たとえば、1 mL の血液中の約 1011 個の EV を処理することは、ハイスループットのセルフローサイトメトリーでは実現できません。一般的なナノ粒子フローサイトメトリーは毎秒約 1,000 カウントの速度で分類 18 し、1 mL の血液を分類するには約 3 年を要しますが、毎秒約 60,000 イベントで分類する最新の細胞内フローサイトメトリーシステムでも 19、1 mL の血液を分類するには 19 日を要します。血。この課題は、800 nm 未満の EV と比較して約 10 μm の細胞の表面積が劇的に増加するため、細胞と比較して EV では表面タンパク質の絶対発現が低いことによってさらに増幅され、その結果、蛍光シグナルが検出レベルを下回ります。市販のフローサイトメトリーシステム20．この課題に対応して、EV サイズのマイクロ/ナノスケールの特徴サイズを使用して、サイズベースまたは表面マーカーの精密な EV 選別を実行する複数のマイクロ流体アプローチが開発されました。しかし、複雑なナノ加工の要件4、21、22、低い最大投入量23、24、単一分子バイオマーカーターゲットへの依存25、または低いサンプルスループット21などの制限により、マイクロ流体サイズまたは表面マーカーEVソーティングの適用性が妨げられてきました。

107 pores/cm2 for d = 600 nm pores5, > 106 for d = 3 µm pores per Cytiva/Whatman). Lastly, track etching combined with vapor deposition of a bilayer, consisting of a soft magnetic layer of NiFe and a passivation layer of Au, offers inexpensive fabrication of large numbers of precisely-defined magnetic nanopores while bypassing expensive and difficult-to-scale lithography5./p> 10% of the magnetic nanopores become occluded. This feature arises because the fluidic resistance of the magnetic nanopores is several orders of magnitude greater than the resistance between pores, and as such when a pore is occluded the flow is distributed not only to its nearest neighbors, but uniformly over the entire 107 pores as if they are in connected in a parallel circuit27. Moreover, in many applications of isolating specific sub-populations of EVs, the subpopulation is sparse (ex. ~ 1900 tumor-derived EVs/mL per mm3 of tumor volume for highly-shedding tumors)28 in comparison to the total number of EVs. Therefore even in a case when TENPO processes 1011 EVs in a mL of human plasma, several orders of magnitude less targeted EVs are captured on the TENPO’s ~ 107 magnetic nanopores. Because our device sorts EVs one at a time, in a device that is matched in scale to that of nanoscale EVs, it can sort EVs based on quantitative expression of surface markers, akin to flow cytometry for cell based sorting. This is in contrast to conventional methods that use micrometer-scale sized beads or devices29, where EV capture is dictated by a single binding event. Moreover, previous immunoaffinity bead isolation methods have been limited by the requirement that a high proportion of EVs express a given target protein30./p>

2.5 mL/h, Rs decreased as a function of flow rate ɸ. At flow rates ɸ < 2.5 mL/h, 1-Rw increased as a function of ɸ, and beyond ɸ > 2.5 mL/h, all weakly targeted EVs were successfully discarded. (Fig. 2C). This model system demonstrates the potential for tuning the tradeoff between Rs and 1-Rw in this model scenario featuring both targeted EVs and off-target EVs with non-specifically bound MNPs./p> 33)./p> 10 mL/h rather than decreasing (Fig. 3C, SI Fig. 11). This difference may be due to differences in magnetic labeling where EVs with greater than 15 MNPs are still captured at high flow rates. We observed no change in isotype-labeled EV RNA at any of the flow rates, in contrast to the predicted decrease in background on simulation. As in the membrane number scan, we hypothesize that the isotype background Cq values are closer to the limit of detection of our PCR assays. We observed the greatest difference between the antibody-labeled versus isotype-labeled EVs at a flow rate of ɸ = 2.5 mL/h (Fig. 3C, SI Fig. 11)./p> .05), while for GAPDH there was a significant difference between the antibody replicates (p = .014) but not the isotype replicates (p > .05)./p> 1000) of clinical samples are required. By virtue of its low construction/operation cost (cost for one pan-EV prototype TENPO assay = ~ $35; $12 material/fabrication5, $5 antibody, $18 beads) and compatibility with roll-to-roll manufacturing, TENPO could be scaled up to fast chip manufacturing while also having the throughput for large clinical cohorts. The fabrication cost of TENPO is invariant to pore diameter, unlike most microfluidic approaches which rely on lithographic fabrication. Previous work in our group with TENPO using 600 nm pores to isolate EV subpopulations was able to yield clinically-relevant diagnostic information in n = 204 pancreatic cancer samples6 as well as in n = 96 traumatic brain injury samples10. In these cases, TENPO using 600 nm pores was able to distinguish biological nucleic acid signals from background, which can be improved even further with the 10× improvement in specificity versus isotype background suggested in this manuscript./p>

~ 3 × 109 EVs for pancreatic cancer, 1 mL—> ~ 9 × 1010 for lung cancer, 1 mL—> ~ 9 × 108 for liver cancer) into healthy human plasma (0.75 mL healthy human plasma for pancreatic cancer, 0.25 mL healthy human plasma for lung and liver cancer; plasma has an EV concentration of 2 × 1012 EVs/mL as measured via NTA). Equivalent volumes of non-conditioned clean culture media (media not exposed to cancer cells) were added to the volumes of healthy human plasma stated for each cancer media type to make the “healthy” samples./p>